BAB I

 PENDAHULUAN I.1. 

Latar Belakang Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumber daya alam hayati, diantaranya adalah hutan basah yang ditumbuhi dengan tanaman yang berkhasiat obat. Penggunaan tanaman obat atau lebih dikenal dengan obat tradisional sebenarnya sudah merupakan warisan nenek moyang.Sejak dahulu masyarakat Indonesia mengenal dan memakai tumbuhan sebagai salah satu upaya dalam penanggulangan masalah kesehatan yang dihadapinya.Namun hal ini dilakukan berdasarkan pengalaman yang turun temurun dan bukan melalui kajian yang sistematis dan terencana. (1) Salah satu tumbuhan tropisIndonesia adalah Sterculiaceae yangmerupakan salah satu famili yangcukup besar, terdiri atas 60 genusdan sekitar 700 spesies.Beberapa spesies tumbuhandari Sterculiaceae telah lamadimanfaatkan oleh masyarakatsebagai obat tradisional.Melochia Umbellata (Houtt)Stapf merupakan salah satu tumbuhan Sterculiaceaeyang dikenal oleh masyarakat diSulawesi Selatan dengan namaPaliasa. Paliasa secara luas telahdimanfaatkan sebagai obattradisional oleh masyarakatkhususnya di Sulawesi Selatan dandipercaya berkhasiat sebagai obatyang mampumengobati penyakit kanker khususnya kanker rahim dan hati (liver), Penyakit tekanan darah tinggi, kolesterol tinggi dan hepatitis.(3,7). Untuk mengetahui kebenaran mengenai senyawa yang terkandung dalam suatu tanaman obat maka perlu dilakukan identifikasi melalui proses isolasi dan karakterisasi senyawa kimia dalam ekstrak tanaman obat tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan senyawa yang terkandung dalam Melochia Umbellata (Houtt)Stapf melalui proses isolasi dan pengkarakterisasian. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi dalam bidang kesehatan, khususnya kefarmasian, mengenai cara untuk mengetahui senyawa yang terkandung dalam Melochia Umbellata (Houtt)Stapf.Memberikan informasi kepada masyarakat tentang daun paliasa sebagai salah satu tanaman obat yang memiliki banyak manfaat dalam pengobatan berbagai penyakit.

 BAB II 

TINJAUAN PUSTAKA II.

1 Uraian Tumbuhan II.1.1 Klasifikasi tanaman (8) Klasifikasi tanaman sebagai berikut : Kingdom : Plantae Subkingdom : Tracheobionta Super Divisi : Spermatophyta Divisi :Magnoliophyta Subdivisi : Dilleniidae Kelas : Magnoliopsida Bangsa :Malvales Suku : Sterculiaceae Marga : Melochia Spesies : Melochia umbellata (Houtt.) Stapf II.1.2. Morfologi Daun (25) Melochia umbellata (Houtt.) Stapf termasuk kedalam famili Sterculiaceae dan genus Melochia yang berasal dari daerah tropis dan sub tropis. Memiliki daun tunggal, menyirip, dan berhadapan, dengan tangkai panjang dan ramping (panjang 7-10 cm),daun secara umum berbentuk oval dengan panjang 13-16,5 cm dan lebar 14 cm, bagian atas daun berwarna hijau,bagian bawah daun hijau kekuning-kuningan, berbulu halus, lembut dan tipis, ujung dan pangkal daunnya bergerigi, berbentuk hati dibagian dasar daun. II.1.3. Nama Daerah (9) Melochia umbellata (Houtt) Stapf adalah salah satu tumbuhan tradisional yang telah lama digunakan oleh masyarakat Sulawesi Selatan. Tumbuhan ini oleh masyarakat Sulawesi Selatan dikenal dengan nama paliasa. II.1.4. Kandungan Kimia (10,11) Melochia umbellata (Suku Sterculiaceae) mengandung senyawa alkaloid. Beberapa spesies dari genus Melochia lain yang telah diketahui kandungan kimianya antara lain alkaloid chamaedrone dan antidesmone yang berkhasiat antimikroba dari M. chamaedrys. Alkaloid melochinone, melonovine-A dan melonovine-B, scutianine dari M. to-mentosa.Alkaloid frangulanine dan waltherione-A, yang berkhasiat antifungi dari M. odorata. Alkaloid myrianthine-B dan lotusanine-A, frangufoline, fra-ngunine dan melofoline dari M. corchorifolia, serta adouetine dan integerrenine dari M.pyramidata . Tumbuhan Melochia umbellata (Houtt) Stapf mengandung minyak atsiri, triterpenoid, alkoid dan flavonoi. Selanjutnya senyawa Stigmasterol (5,22-stigmastadien-3β-ol) yang diosolasi dari kayu akar M.umbellata (Houtt.) Stapf mampu menghambat pertumbuhan Aspergillus niger. II.1.5. Khasiat (3) Secara empiris digunakan untuk mengobati penyakit kanker khususnya kaker rahim dan hati (liver), Penyakit tekanan darah tinggi, kolesterol tinggi dan hepatitis. II.2 Metode Ekstraksi II.2.1 Pengertian (12,13) Ekstraksi adalah penyarian zat-zat aktif dari bagian tanaman obat. Proses pengekstraksian komponen kimia dalam sel tanaman yaitu pelarut organik akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut organik di luar sel, maka larutan terpekat akan berdifusi keluar sel dan proses ini akan berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif di dalam dan di luar sel. Tujuan ekstraksi adalah untuk menarik semua komponen kimia yang terdapat dalam simplisia. Ekstraksi ini didasarkan pada perpindahan massa komponen zat padat ke dalam pelarut dimana perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka, kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut. (6) II.2.2 Metode maserasi(14,15,16) Metode maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana, yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari selama beberapa hari pada temperatur yang terlindung oleh cahaya. Bahan baku yang sudah dibuat serbuk dilembabkan terlebih dahulu, baru kemudian dituangi cairan penyari. Prinsip kerja dari maserasi adalah serbuk simplisia direndam dalam wadah maserasi dengan pelarut yang sesuai selama 5 hari dan setiap 24 jam dilakukan pengadukan, setelah 5 hari disaring.Maserasi dilakukan 3 x 5 hari, kalau dapat diusahakan penyimpanan dilakukan pada suhu 15oC hingga 20oC.Adapun macam-macam sampel yang bisa dimaserasi adalah simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung bahan yang mudah mengembang dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, stirak, dll.Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Kerugian cara maserasi adalah pengerjaannya lama dan penyariannya kurang sempurna. Macam-macam maserasi yaitu: Maserasi digesti Maserasi yang dilakukan dengan menggunakan pemanasan lemah suhu 40-500C, untuk komponen kimia yang tahan terhadap pemanasan. Maserasi dengan mesin pengaduk Penggunaan mesin pengaduk yang dapat berputar terus-menerus dapat mempercepat proses ekstraksi sehingga dalam waktu 6-24 jam maserasi dapat selesai. Maserasi remaserasi Maserasi remaserasi adalah penyarian yang dilakukan dengan membagi dua cairan penyari yang digunakan kemudian seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienap tuangkan dan diperas ampasnya lalu dimaserasi kembali dengan cairan penyari kedua. Maserasi melingkar Maserasi melingkar adalah penyarian yang dilakukan dengan menggunakan cairan penyari yang selalu bergerak dan menyebar (berkesinambungan) sehingga kejenuhan cairan penyari merata. Maserasi melingkar bertingkat Maserasi melingkar bertingkat adalah sama dengan maserasi melingkar tetapi pada maserasi melingkar bertingkat dilengkapi dengan beberapa bejana penampungan sehingga tingkat kejenuhan cairan penyari setiap bejana berbeda-beda. II.3 Metode Isolasi Bahan Alam II.3.1 Krimatografi Lapis Tipis (17,18,19) Kromatografi Lapis Tipis (KLT) atau Thin Layer Chromatographysalah satu bentuk dari kromatografi cair padat (KCP) merupakan teknik analisis sederhana untuk memisahkan komponen secara cepat berdasarkan prinsip partisi dan adsorpsi.Kromatografi lapis tipis terbuat dari lempeng gelas atau logam yang tahan karat atau lempengan tipis yang cocok sebagai penyangga. Kromatografi lapis tipis adalah kromatografi cair-cair dimana sebagai fase diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh lempeng gelas atau aluminium yang dilapisi dengan lapisan tipis aluminika, silika gel atau bahan serbuk lainnya. Prinsip KLT adalah pemisahan secara fisikokimia berdasarkan adsorpsi dan partisi.Lapisan yang memisahkan terdiri dari bahan yang berbutir-butir (fase diam), ditempatkan dalam penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan yang ditotolkan berupa bercak atau pita (awal). Setelah plat atau lapisan ditaruh di dalam bejana yang ditutup rapat berisi fase gerak, pemisahan terjadi selama pengembangan.Senyawa berwarna terdeteksi. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan berbagai senyawa seperti ion-ion anorganik, dan senyawa organik baik yang terdapat di alam dan senyawa organi sintetik.Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah karena dapat dihasilkan pemisahan yang sempurna, kepekaan yang lebih tinggi dan dapat dilaksanakan dengan lebih cepat. Kekurangan KLT adalah penyapuan plat, biasanya mengalami kesulitan dalam hal homogenitas bubur silika gel diatas plat. Penyerap umum yang digunakan adalah silika gel,aluminium oksida, kieselguhr, selulosa dan turunannya, poliamida, dan lain-lain.Silica gel adalah penyerap yang banyak digunakan karena mempunyai pemisahan yang baik. Zat penyerap dilapiskan secara merata pada penyangga dengan ketebalan lapisan antara 0,1-0,3 mm. Pemisahan suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap, dan sifat daya serap masing-masing komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa fase diam (penyerap) dengan kecepatan bergeraknya komponen terlarut dalam fase gerak (pelarut) adalah dasar untuk mengidentifikasi komponen yang dipisahkan, perbandingan kecepatan ini dinyatakan dengan Rf (Rate of flow) dengan persamaan. Prinsip penampakan noda pada lempeng kromatografi melalui tiga cara yaitu: Pada UV 254 nm, lempeng akan berfluoresensi sedangkan sampel akan tampak berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada lempeng.Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi. Pada UV 366 nm noda akan berfluoresensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh ausokrom yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi.Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak berfluoresensi pada sinar UV 366 nm. Prinsip penampakan noda pereaksi semprot H2SO4 10% adalah berdasarkan kemampuan asam sulfat yang bersifat reduktor dalam merusak gugus kromofor dari zat aktif simplisia sehingga panjang gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih panjang (UV menjadi VIS) sehingga noda menjadi tampak oleh mata. II.3.1.1 Harga Rf (Retension factor) (19) Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi warna.Lazimnya identifikasi menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Dapat didefinisikan sbb: Rf=(Jarak yang ditempuh senyawa pelarut)/(Jarak yang ditempuh pelarut) Faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Rf dari KLT Struktur kimia dari senyawa yang akan dipisahkan. Sifat dari penjerap dan derajat aktivitasnya. Perbedaan penjerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rf meskipun menggunakan fase gerak dan solute yang sama, tapi hasil dapat diulang dengan hasil yang sama, hanya akan diperoleh jika menggunakan penjerap yang sama. Juga ukuran partikel tetap dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen. Tebal dan kerataan lapisan penjerap. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tidak rata. Pelarut dan derajat kemurniannya. Derajat kemurnian dari uap dalam mana bejana pengembangan yang digunakan. Jumlah cuplikan yang digunakan Panjang trayek migrasi Adanya zat asing atau pencemar II.3.2 Kromatografi kolom (20) Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran.Alat tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran di bagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair. Ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang akan dipisahkan, perbadingan panjang dan diameter kolom sekitar 8:1, sedangkan jumlah penyerapnya adalah 25-30 kali berat bahan yang akan dipisahkan. Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita, senyawa larut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar atas kolom Kromatografi adalah proses pemisahan yang tergantung pada perbedaan distribusi campuran komponen antara fase gerak dan fase diam. Fase diam dapat berupa pembentukan kolom dimana fase gerak dibiarkan untuk mengalir (kromatografi kolom) atau berupa pembentukan lapis tipis dimana fase gerak dibiarkan untuk naik berdasarkan kapilaritas (kromatografi lapis tipis). Perlu diperhatikan bahwa senyawa yang berbeda memiliki koefisien partisi yang berbeda antara fase gerak dan diam.Senyawa yang berinteraksi lemah dengan fase diam akan bergerak lebih cepat melalui sistem kromatografi. Senyawa Pemisahan komponen campuran melalui kromatografi adsorpsi tergantung pada kesetimbangan adsorpsi-desorpsi antara senyawa yang teradsorbsi pada permukaan dari fase diam padatan dan pelarut dalam fase cair.Tingkat adsorpsi komponen tergantung pada polaritas molekul, aktivitas adsorben, dan polaritas fase gerak cair.Umumnya, senyawa dengan gugus fungsional lebih polar akan teradsorb lebih kuat pada permukaan fase padatan. Aktivitas adsorben tergantung komposisi kimianya, ukuran partikel, dan pori-pori partikel. II.3.3 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) (19,21) Salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan paling dasar adalah kromatografi lapis tipis preparatif.Metode KLTP dapat memisahkan bahan dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaiannya hanya dalam jumlah miligram. Pemisahan komponen kimia dengan metode KLTP pada dasarnya sama dengan KLT biasa, namun perbedaan yang nyata ialah pada KLTP menggunakan lempeng yang besar (ukuran 20 x 20 cm dan 20 x 40 cm) dengan ketebalan 0,5-2 mm dan smapel ditotolkan berupa garis lurus pada salah satu sisi lempeng. Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada pelat KLTP.Pelarut yang baik ialah pelarut atsiri (heksana, diklorometan, etil asetat).Karena jika bukan pelarut atsiri akan menyebabkan pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10 %.Cuplikan ditotol harus sesempit mungkin karena pemisahan bergantung pada lebar pita, penotolan dapat dilakukan dengan tangan (pipet) tetapi lebih baik dengan penotol otomatis, dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita yang kedudukannya telah diketahui melalui KLT, dikerok dari pelat dengan menggunakan spatula.Hasil kerokan tersebut dikumpulkan di ata corong dengan kertas filter.Kemudian diekstrak dengan pelarut yang polaritasnya cukup untuk melarutkan secara kuantitatif.KLT preparatif harus dikerjakan secepat mungkin untuk tidak terjadi kerusakan pada masing-masing komponen penyusun.Penampakan pita yang mengandung cuplikan pada KLT preparatif dapat dilakukan dengan menggunakan sinar UV dan pereaksi semprot. II.3.4 Kromatografi Lapis Tipis Dua Dimensi (22) Kromatografi lapis tipis tipis 2 dimensi pada prinsipnya sama dengan kromatogarfi Lapis Tipis biasa, dengan prinsip adsorbsi dan partisi. Kromatografi ini digunakan untuk menentukan apakah komponen kimia yang telah diisolasi sebelumnya merupakan zat aktif tunggal atau tidak. Kromatografi ini menggunakan lempeng persegi berukuran 10 x 10 cm atau 20 x 20 cm, dimana noda ditotol pada 2 sisi lempeng. Artinya lempeng setelah dielusi pertama kali dan menampakkan noda, selanjutnya diputar pada arah 900 sehingga noda yang terbentuk dari hasil elusi dengan eluen pertama terelusi lagi oleh eluen kedua. Jika noda yang terbentuk pada hasil elusi kedua tetap tunggal maka dapat disimpulkan fraksi tersebut merupakan zat tunggal, yang selanjutnya dapat dimurnikan. Pemilihan eluen kedua ditentukan oleh Rf noda yang terbentuk oleh elusi menggunakan eluen pertama, dimana bila Rf terlalu tinggi (noda berada terlalu diatas), digunakan eluen dengan tingkat kepolaran lebih kecil dibandingkan dengan eluen pertama, sedangkan jika nilai Rf sangat kecil (noda terlalu di bawah) digunakan eluen yang lebih polar dibandingkan eluen pertama. II.4 Spektroskopi(23) Spekstroskopi adalah studi mengenai interaksi cahaya dengan atom dan molekul. Radiasi cahaya dan elektromagnetik dapat dianggap menyerupai gelombang. II.4.2 Spektrofotometri Inframerah (23) Spektrofotometri inframerah merupakan teknik spektrofotometri tercepat dan termurah yang digunakan dalam kimia organik.Sampel dapat berupa padatan, cairan atau gas, dan dapat diukur dalam larutan dengan KBr atau minyak mineral.Kemudian spektrum dapat diperoleh hanya dalam beberapa menit dari material murni parsial dengan tujuan memberikan indikasi bahwa reaksi yang terjadi seperti yang diinginkan. Identifikasi senyawa yang tidak diketahui gugus fungsinya dapat diuji struktur inframerahnya, kemudian dideteksi menggunakan data korelasi (Sastrohamidjojo, 1991).Menurut Pavia, et al., (1988), langkah-langkah umum untuk memeriksa pita serapan adalah sebagai berikut : Apakah terdapat gugus karbonil ? Gugus C=O memberikan puncak pada daerah 1820-1660 cm-1. Puncak ini biasanya merupakan yang terkuat dengan lebar medium dalam spektrum. Jika gugus C=O ada, periksa gugus-gugus berikut. Jika tidak ada, langsung ke nomor 3. Asam : Apakah ada O-H ? Serapan lebar di daerah 3300-2500 cm-1. Biasanya tumpang tindih dengan C-H. Amida : Apakah ada N-H? Serapan medium di dekat 3500 cm-1, kadang-kadang dengan puncak rangkap. Ester : Apakah ada C-O? Serapan medium di daerah 1300-1000 cm-1. Anhidrida: Mempunyai dua serapan C=O di daerah 1810 dan 1760 cm-1. Aldehida : Apakah ada C-H aldehid? Dua serapan lemah di daerah 2850-2750 cm-1 yaitu di sebelah kanan serapan C-H. Keton : Jika kelima kemungkinan di atas tidak ada. 3. Bila gugus C=O tidak ada. a. Alkohol/fenol: Periksa gugus O-H, merupakan serapan lebar di daerah 3600-3300 cm-1 yang diperkuat adanya serapan C-O di daerah 1300-1000 cm-1. b. Amina : Periksa gugus N-H, yaitu serapan medium di daerah 3500 cm-1. c. Eter : Periksa gugus C-O (serapan O-H tidak ada), yaitu serapan medium di daerah 1300-1000 cm-1. 4. Ikatan rangkap dua dan/atau cincin aromatik. C=C mempunyai serapan lemah di daerah 1650 cm-1. Serapan medium sampai kuat pada daerah 1650-1450 cm-1 sering menunjukkan adanya cincin aromatik. Buktikan kemungkinan di atas dengan memperhatikan serapan pada daerah C-H aromatik di sebelah kiri 3000 cm-1, sedangkan C-H alifatis terjadi di sebelah kanan daerah tersebut. 5. Ikatan rangkap tiga. C≡N mempunyai serapan medium dan tajam di daerah 2250 cm-1. C≡C mempunyai serapan lemah tapi tajam di daerah 2150 cm-1. Periksa juga CH asetilenik di dekat 3300 cm-1. 6. Gugus nitro. Dua serapan kuat di daerah 1600-1500 cm-1 dan 1390-1300 cm-1. 7. Hidrokarbon. a. Apabila keenam kemungkinan di atas tidak ada. b. Serapan utama di daerah C-H dekat 3000 cm-1. c. Spektrum sangat sederhana, hanya terdapat serapan lain di daerah 1450-1375 cm-1.

 BAB III PELAKSANAAN PENELITIAN 

III.1. Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi STIFA Makassar dan Laboratorium Biofarmaka Pusat Kegiatan Penelitian UNHAS Makassar. III.2. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain : seperangkat alat gelas laboratorium, lampu Ultra Violet 254 dan 366 nm, lempeng kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom, lempeng kromatografi lapis tipis preparatif, spektrofotometri infra merah. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain :Daun paliasa (Melochia Umbellata (Houtt)Stapf.), n-heksan, metanol, etil asetat, kloroform, silika gel 40, plat KLT III.3. Metode Kerja III.3.1. Pengambilan Sampel Sampel dikumpulkan didaerah Makassar,jl. Racing centre kelurahan panaikang, Sulawesi Selatan. III.3.2. Pengolahan Sampel Melochia Umbellata ( huott )stapf yang telah dikumpulkan dicuci hingga bersih dengan air mengalir lalu dikeringkan. Setelah kering, daun diiris kecil-kecil lalu dikeringkan dalam lemari pengering dengan suhu 40°C. III.3.3. Pembuatan Ekstrak Ekstraksi Melochia Umbellata (Houtt)Stapf dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol selama 3 hari, lalu disaring. Ekstrak kemudian diuapkan hingga diperoleh ekstrak kental. III.4.4. Proses Pemisahan III.4.4.1. Kromatografi Lapis Tipis Sebelum melakukan proses pemisahan secara KLT, lempeng silika gel terlebih dahulu diberi garis batas elusi dan dipanaskan dalam oven dengan suhu 115°C selama 15 menit. Ekstrak kering dilarutkan dengan pelarut metanol lalu disimpan dalam wadah vial.Setelah itu ditotolkan pada lempeng silika gel. Eluen yang digunakan adalah eluen gabungan dari pelarut N-heksan dan Etil asetat (8:2).Setelah itu eluen dijenuhkan dalam chamber dengan menggunakan kertas saring.Selanjutnya lempeng silika gel yang telah ditotol dengan ekstrak dimasukkan ke dalam chamber dan kemudian dielusi.Pengamatan terhadap penampakan noda dilakukan dengan menggunakan sinar UV 254 nm dan 366 nm. III.4.4.2. Fraksinasi Seperangkat alat kromatografi kolom disiapkan, kemudian ke dalam tabung kolom dimasukkan silika gel sebanyak 30 gram dengan menggunakan metode basah (bubur silika gel) sambil diketuk-ketuk tabung kolom hingga mampat. Ekstrak sebanyak 300mgdilarutkan dengan menggunakan pelarut metanol, kemudian dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit.Setelah itu dielusi dengan dengan eluen N-heksan : Etil asetat dengan bebagai macam perbandingan ( 10 : 0, 9 :1, 8 : 2, 7 : 3, 6 : 4, 5 : 5, 4 : 6, 3 : 7, 2 : 8, 1:9, 0:10). Hasil yang keluar ditampung dalam vial berupa fraksi. Fraksi-fraksi tersebut kemudian digabungkan berdasarkan kesamaan warnanya lalu dilakukan kromatografi lapis tipis dan dielusi dengan menggunakan eluen N-heksan dan Etil asetat dengan perbandingan (8:2).Kemudian fraksi-fraksi tersebut diuapkan. III.4.4.3. Isolasi Fraksi gabungan dari KLT dilanjutkan pada Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) dengan menggunakan fase diam silika dan fase gerak dengan eluen N-heksan dan Etil asetat dengan perbandingan (8:2).Selanjutnya isolat yang diperoleh dilakukan Kromatografi Lapis Tipis untuk memastikan adanya satu noda dari isolat. III.4.4.4. Uji Kemurnian Uji kemurnian dilakukan dengan menggunakan campuran fase gerak antara Etil asetat dan Metanol.Jika isolat menunjukkan noda tunggal pada plat kromatografi maka isolat tersebut relatif murni secara KLT atau dengan kata lain hanya mengandung satu macam senyawa. III.4.4.5. Karakterisasi Isolat Karakterisasi isolate murni dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer IR ( Infra Red ) III.4. Pengumpulan dan Pengolahan Data Pengumpulan dan pengolahan data mencakup pemisahan, pemurnian dan pengkarakterisasian.